Producción, purificación y caracterización de la poligalacturonasa de una cepa de levadura aislada de residuales del beneficio húmedo del café

Abstract

El conocimiento existente sobre la diversidad y potencial productivo de las levaduras ectinolíticas, así como sobre los factores que determinan la síntesis de estos enzimas es bastante limitado. En esta tesis se efectúa el aislamiento e identificación de seis cepas de levaduras pectinolíticas procedentes de frutos y residuales del beneficio húmedo del café, al tiempo que se presenta una caracterización de la diversidad de levaduras que habitan estos materiales. Se reporta por vez primera la existencia de este fenotipo en la especie Hansenula jadinii y se propone una novedosa metodología para el aislamiento selectivo de levaduras pectinolíticas, basada en la aptitud de estas estirpes para crecer en cultivo limitado de oxígeno. Uno de los aislados, designado como Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011, exhibe los mayores acumulados de poligalacturonasa (PG) extracelular reportados hasta el presente para una levadura salvaje. Se demuestra que la síntesis de PG en esta cepa es asociada al crecimiento y regulada negativamente por oxígeno, en tanto no se afecta por la presencia de sustancias pécticas en el medio y no sufre de represión catabólica, incluso a concentraciones del catabolito de 100 g⋅L-1. Se aportan nuevos conocimientos en lo concerniente a los factores que afectan la producción de PG en levaduras, tales como oxigenación del cultivo, condiciones de estrés y actividad de la ruta glucolítica. Se demuestra la viabilidad técnica de la producción simultánea de alcohol y PG a escala piloto en esta cepa. Se purifica el enzima hasta homogeneidad electroforética, con buenos niveles de recobrado y actividad específica, mediante un procedimiento a simple etapa en cromatografía de intercambio iónico. Se establece que a la PG de K. marxianus CCEBI 2011 corresponde una masa molecular de 41,7 kDa y que el enzima clasifica como una endopoligalacturonasa (endo-PG) típica, termoestable, activa a pHs ácidos y frente a pectinas de alto grado de esterificación. La cepa seleccionada constituye una atractiva alternativa para la valorización de la industria alcoholera y el aprovechamiento de residuos agrícolas pectináceos, al tiempo que se vislumbra un promisorio campo de aplicaciones para la PG producida.

Existing knowledge about the diversity and productive potential of ectinolytic yeasts, as well as about the factors that determine the synthesis of these enzymes, is quite limited. In this thesis, the isolation and identification of six strains of pectinolytic yeasts from fruits and residuals of the wet processing of coffee is carried out, while a characterization of the diversity of yeasts that inhabit these materials is presented. The existence of this phenotype in the Hansenula jadinii species is reported for the first time and a novel methodology for the selective isolation of pectinolytic yeasts is proposed, based on the ability of these strains to grow in oxygen-limited culture. One of the isolates, designated as Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011, exhibits the highest accumulation of extracellular polygalacturonase (PG) reported to date for a wild yeast. It is shown that PG synthesis in this strain is associated with growth and negatively regulated by oxygen, as it is not affected by the presence of pectic substances in the medium and does not suffer from catabolic repression, even at catabolite concentrations of 100 g⋅ L-1. New knowledge is provided regarding the factors that affect PG production in yeast, such as culture oxygenation, stress conditions and activity of the glycolytic pathway. The technical feasibility of the simultaneous production of alcohol and PG on a pilot scale in this strain is demonstrated. The enzyme is purified to electrophoretic homogeneity, with good levels of recovery and specific activity, by means of a single-step procedure in ion exchange chromatography. It is established that the PG of K. marxianus CCEBI 2011 corresponds to a molecular mass of 41.7 kDa and that the enzyme classifies as a typical endopolygalacturonase (endo-PG), thermostable, active at acidic pHs and against pectins with a high degree of esterification The selected strain constitutes an attractive alternative for the recovery of the alcohol industry and the use of pectinaceous agricultural residues, while a promising field of applications for the PG produced is glimpsed.