Bioprospecting and taxonomy of isolates of the class Actinobacteria and the genus Bacillus from aquatic ecosystems of Santiago de Cuba

Abstract

Up to date more that 30,000 antibiotics from natural sources are known, from which 25,000 have been produced by microorganisms. Despite that, the ever-envolving multi-drug resistant (MDR) bacteria need of the discovery of more antibiotics with new mechanisms of action to avoid the morbidity and mortality produced by these pathogens at the worldwide public health (Chapter 1). Members of the class Actinobacteria (mainly filamentous actinobacteria) are the most important bacteria for medical-pharmaceutical industry by their capacities to produce a wide range of bioactive compounds (45% of all known microbial bioactive metabolites). Streptomyces is a prolific genus that has produced the 34% of these bioactives. Rare actinobacteria (non-Streptomyces) have produced a lesser number of metabolites (11%), but with novel structures and action mechanisms. Although to a lesser extent, other bacteria such as the belonging to the genus Bacillus produce important compounds (7%) with antimicrobial potentialities (Chapter 2). Most of these bioactives have been obtained from terrestrial sources, and the current bioprospecting studies in this habitat have led compounds already known. Today, the search of novel antibiotics is addressed towards unexplored or less-explored habitats, such as aquatic environments (Chapter 3). Aquatic habitats of Santiago de Cuba are less-explored sources that might hold a huge microbial diversity. This research was focused to bioprospect members of the class Actinobacteria and the genus Bacillus with antibacterial potential in three aquatic habitats of Santiago de Cuba (Chapter 7). Samples of two freshwater sediments of the rivers San Pablo and Carpintero, and marine macroalgae collected in Juraguá were used as lessexplored sources. Fresh samples and pre-treated samples by using air-dried (freshwater sediments) and freezing (macroalgaes) were used. One hundred and six bacteria were retrieved from the samples, of which 83 belonged to the bacterial groups under study. Sixty-nine isolates were obtained with the fair application of three selective methods (M1- M3) based on physico-chemical approaches (wet-heat at 55oC; 0.2 & 0.5% phenol) and use of four culture media: two selective media for actinobacteria and two media for general use for bacteria. Fourteen isolates were obtained from San Pablo samples, by the application of a fourth selective method (M4) more restrictive by using dry-heat at 105oC as well. Matrix Assisted Laser Desorption-Ionization in Time Of Flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) was tested as a phenotypic tool to describe the taxonomical composition of the class Actinobacteria and the genus Bacillus in the sampled aquatic habitats (Chapter 7). The taxonomic identification of the 73.58% of the isolates confirmed that MALDI-TOF MS is an accurate high-throghput technique to identify bacteria from environmental samples. Some drawbacks reported for this technique might explain the no reliable identification of 28 isolates. The low resolution rate of the 16S rRNA gene to differentiate species of the genera Bacillus, Arthrobacter, Dietzia, Micrococcus, Micromonospora, Nocardiopsis, and Streptomyces was corroborated in this study. The high resolution of gyrA gene for genus Bacillus led the identification of five isolates. But, the phylogenetic divergence level of gyrB gene was not enough to define at species level one isolate of Micromonospora. A polyphasic approach that included the analysis of those phenotypic (also chemotaxonomic), genotypic, and genomic features [by using the Overall Genome Relatdness Indexes (ANI, OrthoANIu, and dDDH) and phylogenomic trees] resulted in a complete taxonomic description of two novel taxa referred as Micromonospora fluminis A38T (Chapter 8) and Nocardiopsis dassonvillei subsp. crassaminis D1T (Chapter 9). Other species were identified through phylogenetic analyses (Chapter 7). Twenty-seven phylotypes belonging to the class Actinobacteria and the genus Bacillus were represented in the three aquatic habitats, from which 19 belonging to Bacillus. Only nine genera of the class Actinobacteria were obtained, of them three of Actinomycetes. This low number of actinobacterial species could be because the slow growth thereof, and the used culturing conditions. Fourteen species of these bacterial groups enriched the already known microbial diversity of the Caribbe. In the second part of this work, the antibacterial potential of those 83 isolates belonging to the class Actinobacteria and the genus Bacillus was evaluated (Chapter 10). The 39.75% of the isolates showed in vitro antibacterial activity against at least one of the tested bacteria through cross-streak method. Most of the active isolates belonged to genus Bacillus, which corresponded to those abundant/common species of this genus recovered from San Pablo, freshwater habitat with a higher pollution grade. The anti-staphylococci activity exhibited by the isolate B. velezensis A3 by cross streak method was corroborated by overlay method against two MDR-Staphylococcus aureus strains. Significative importance has the inhibitory effect of Micromonospora fluminis A38T against the panresistant carbapenemase-producing bacteria OXA-48-producing Klebsiella pneumoniae and OXA-24-producing Acinetobacter baumanii.

Hasta la fecha se conocen más de 30.000 antibióticos de origen natural, de los cuales 25.000 han sido producidos por microorganismos. A pesar de eso, las bacterias multirresistentes (MDR) en constante evolución necesitan el descubrimiento de más antibióticos con nuevos mecanismos de acción para evitar la morbilidad y mortalidad producidas por estos patógenos en la salud pública mundial (Capítulo 1). Los miembros de la clase Actinobacteria (principalmente actinobacterias filamentosas) son las bacterias más importantes para la industria médico-farmacéutica por su capacidad para producir una amplia gama de compuestos bioactivos (45% de todos los metabolitos bioactivos microbianos conocidos). Streptomyces es un género prolífico que ha producido el 34% de estos bioactivos. Las actinobacterias raras (no Streptomyces) han producido una menor cantidad de metabolitos (11%), pero con estructuras y mecanismos de acción novedosos. Aunque en menor medida, otras bacterias como las pertenecientes al género Bacillus producen compuestos importantes (7%) con potencialidades antimicrobianas (Capítulo 2). La mayoría de estos bioactivos se han obtenido de fuentes terrestres, y los actuales estudios de bioprospección en este hábitat han dado lugar a compuestos ya conocidos. Hoy en día, la búsqueda de nuevos antibióticos se dirige a hábitats inexplorados o menos explorados, como los ambientes acuáticos (Capítulo 3). Los hábitats acuáticos de Santiago de Cuba son fuentes menos exploradas que podrían albergar una enorme diversidad microbiana. Esta investigación estuvo enfocada a bioprospeccionar miembros de la clase Actinobacteria y el género Bacillus con potencial antibacteriano en tres hábitats acuáticos de Santiago de Cuba (Capítulo 7). Como fuentes menos exploradas se utilizaron muestras de dos sedimentos de agua dulce de los ríos San Pablo y Carpintero, y macroalgas marinas recolectadas en Juraguá. Se utilizaron muestras frescas y muestras pretratadas mediante secado al aire (sedimentos de agua dulce) y congelación (macroalgas). De las muestras se recuperaron 106 bacterias, de las cuales 83 pertenecían a los grupos bacterianos estudiados. Se obtuvieron sesenta y nueve aislados con la aplicación justa de tres métodos selectivos (M1-M3) basados en enfoques fisicoquímicos (calor húmedo a 55oC; 0,2 y 0,5% de fenol) y el uso de cuatro medios de cultivo: dos medios selectivos para actinobacterias. y dos medios de uso general para bacterias. Se obtuvieron catorce aislamientos de muestras de San Pablo, mediante la aplicación de un cuarto método selectivo (M4) más restrictivo al utilizar también calor seco a 105oC. Se probó la espectrometría de masas con desorción-ionización láser asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) como herramienta fenotípica para describir la composición taxonómica de la clase Actinobacteria y el género Bacillus en los hábitats acuáticos muestreados (Capítulo 7). La identificación taxonómica del 73,58% de los aislados confirmó que MALDI-TOF MS es una técnica precisa de alto rendimiento para identificar bacterias en muestras ambientales. Algunos inconvenientes reportados para esta técnica podrían explicar la identificación no confiable de 28 aislamientos. La baja resolución del gen 16S rRNA para diferenciar especies de los géneros Bacillus, Arthrobacter, Dietzia, Micrococcus, Micromonospora, Nocardiopsis y Streptomyces fue corroborado en este estudio. La alta resolución del gen gyrA para el género. Bacillus lideró la identificación de cinco aislamientos. Pero, el nivel de divergencia filogenética de El gen gyrB no fue suficiente para definir a nivel de especie un aislado de Micromonospora. Un enfoque polifásico que incluyó el análisis de esas características fenotípicas (también quimiotaxonómicas), genotípicas y genómicas [mediante el uso de los índices de relación general del genoma (ANI, OrthoANIu y dDDH) y árboles filogenómicos] dio como resultado una descripción taxonómica completa de dos nuevos taxones. denominada Micromonospora fluminis A38T (Capítulo 8) y Nocardiopsis dassonvillei subsp. crassaminis D1T (Capítulo 9). Otras especies fueron identificadas mediante análisis filogenéticos (Capítulo 7). En los tres hábitats acuáticos estuvieron representados veintisiete filotipos pertenecientes a la clase Actinobacteria y al género Bacillus, de los cuales 19 pertenecen a Bacillus. Sólo se obtuvieron nueve géneros de la clase Actinobacteria, de ellos tres de Actinomycetes. Este bajo número de especies actinobacterianas podría deberse al lento crecimiento de las mismas y a las condiciones de cultivo utilizadas. Catorce especies de estos grupos bacterianos enriquecieron la ya conocida diversidad microbiana del Caribe. En la segunda parte de este trabajo se evaluó el potencial antibacteriano de aquellos 83 aislados pertenecientes a la clase Actinobacteria y al género Bacillus (Capítulo 10). El 39,75% de los aislados mostraron actividad antibacteriana in vitro contra al menos una de las bacterias analizadas mediante el método de racha cruzada. La mayoría de los aislamientos activos pertenecían al género Bacillus, que correspondía a aquellas especies abundantes/comunes de este género recuperadas de San Pablo, hábitat de agua dulce con mayor grado de contaminación. Actividad antiestafilococos exhibida por el aislado B. velezensis A3 mediante el método de raya cruzada se corroboró mediante el método de superposición contra dos cepas de Staphylococcus aureus MDR. De importancia significativa tiene el efecto inhibidor de Micromonospora fluminis A38T contra las bacterias panresistentes productoras de carbapenemasas Klebsiella pneumoniae productoras de OXA-48 y Acinetobacter baumanii productoras de OXA-24.